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WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)

简要描述:WB(普通蛋白,磷酸化蛋白),通过电泳区分不同的蛋白组分,并转移至固相支持物(膜),通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测。可检测到低至1~5ng(可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。

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  • 厂商性质:生产厂家
  • 更新时间:2023-12-20
  • 访  问  量:2493
详情介绍

实验收费标准:

项目编号项目名称计价单位单价

ZC1102

WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)

140元

WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)服务介绍:

      通过电泳区分不同的蛋白组分,并转移至固相支持物(膜),通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测。可检测到低至1~5ng(Low可到10~100pg)中等大小的靶蛋白。


实验结果展示:


WB(普通蛋白,磷酸化蛋白)实验流程:

   Western Blot实验步骤

        1、 细胞总蛋白提取

      (1)对于悬浮细胞: 离心收集细胞,每106细胞加250 ul  RIPA(在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂),振荡。如果需要提高蛋白浓度,可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。

      (2) 对于贴壁细胞:

        ① 用TBS冲洗细胞2-3次。最后一次*吸干残留液。

        ② 加入适当体积的 RIPA(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)于培养板、瓶内3-5min。期间反复晃动培养板、瓶,使试剂与细胞充分接触。

        ③ 用细胞刮刀将细胞及试剂刮下,收集到1.5ml离心管中。

      (3) 冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞*裂解。

      (4) 12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

        2、 组织蛋白提取:

      (1) 组织块用冷TBS洗涤2-3次,去除血污,剪成小块置于匀浆器。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂)冰上*匀浆。如果需要提高蛋白浓度,可以适量减少该试剂体积。

      (2) 将匀浆液转移至1.5ml离心管中,振荡。冰浴30min,期间用移液器反复吹打,确保细胞*裂解。

      (3) 12000g离心5min,收集上清,即为总蛋白溶液。

        3、 蛋白浓度测定:BCA法侧蛋白浓度

        4、 SDS-PAGE电泳

      (1) 清洗玻璃板

      (2)灌胶与上样

        ① 将玻璃板对齐后放入夹中卡紧,操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。

        ② 按实验安排配制分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。大约45min后可倒去胶上层水并用吸水纸将剩余水吸干。

     分离胶配比


分离胶浓度
试剂8%10%12%15%18%20%8%10%12%15%18%20%
H2O   ml4.6343.32.31.30.636.95.94.93.41.90.9
30%丙烯酰胺(29:1) ml2.673.34566.674567.5910
1.5M TRIS-Hcl(PH 8.8) ml2.52.52.52.52.52.53.83.83.83.83.83.8
10%SDS ml0.10.10.10.10.10.10.150.150.150.150.150.15
AP  ml0.10.10.10.10.10.10.150.150.150.150.150.15
TEMED  ul5ul5ul5ul5ul5ul5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul7.5ul
总体积 ml10ml15ml

   

    5%浓缩胶配比
试剂浓度   5%
H2O ml2346
30%丙烯酰胺(29:1)ml0.50.7511.5
1M  TRIS-Hcl(PH 6.8)ml0.50.7511.5
10%SDS ul406080120
AP  ul30456090
TEMED  ul4ul6ul8ul12ul
总体积 ml3ml4.5ml6ml9ml

 ③ 按前面方法配5%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。

(3) 加足够的电泳液后上样电泳。将样品加入电泳孔中,电泳。浓缩胶电压75V,分离胶用120V。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳,进行转膜。

5 转膜  (小于20kd的蛋白请使用0.22um的PVDF膜。)

(1)准备6张7×9cm的滤纸和一张大小适中的 PVDF膜,PVDF膜在使用之前要先用甲醇活化。

(2) 在加有转移液的盆里放入转膜用的夹子,两块海绵垫,一支玻棒,滤纸和经过活化的PVDF膜。

(3)将夹子打开使黑的一面保持水平。在垫子上垫海绵、三层滤纸。

(4)小心剥下分离胶盖于滤纸上,将膜盖于胶上,并除气泡。在膜上盖三张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫。

(5)转膜条件(湿转)

 ① 快转。300mA恒流转膜半小时,或者200mA转膜1小时,时间可以略微调整,时间对应调整。

 ② 慢转。转膜过夜,25V恒压转膜过夜。

  6 免疫反应

 ① 将转好的膜于室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配),封闭1h。

 ① 稀释一抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶,磷酸化蛋白使用TBST溶解的5%BSA),4℃孵育过夜(快转),或者4℃孵育抗体3小时(慢转)。

 ③用TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min

 ④ 将二抗用TBST稀释3000倍,室温下孵育30min后,用TBST在室温下脱色摇床上洗三次,每次5min

  7 化学发光 将ECLA和ECLB两种试剂在离心管中等体积混合,将PVDF膜的蛋白面朝上与此混合液充分接触,1-2min后,去尽残液,包好,放入暗匣中曝光。最后用显影、定影试剂进行显影和定影。根据不同的光强度调整曝光条件。

  8 凝胶图像分析 将胶片进行扫描存档,PhotoShop整理去色,Alpha软件处理系统分析目标带的光密度值。

蛋白样品制备的注意事项:

     1、细胞数量达5×106

     2、将细胞裂解液再离心,收集上清液,加loading煮样5min。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳注意事项:

    1、做胶:防止漏胶、进气泡以及花胶(水封、插梳子和拔梳子)

    2、加样:两边加loading,加样量一样,加样时间要尽量短,以免样品扩散。

    3、电泳:将胶夹好放于电泳槽中,加电泳buffer(内外面不能联通),将电压调到90V开始电泳。

转膜注意事项:

     1、泡膜:转膜之前将海绵、胶、膜都用预冷的转移buffer浸泡20min。(1.凝胶若是没在预冷的转膜buffer中浸泡,就会在转膜过程中出现凝胶皱缩,导致出现转移条带变形。2.PVDF膜具有疏水性,需用甲醇浸泡)

    2、转膜顺序:阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板

    3、转膜条件:0.35A 250V 1h40min 冰浴中进行转膜(具体转膜时间要根据目的蛋白的大小而定;目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,反之则短)

    4、避免直接用手碰杂交膜,使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。

    5、夹好膜和凝胶后,确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转膜不*。

    6、保证膜和滤纸的大小和凝胶*一样,过大和过小都会影响转膜效率。

    7、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力,从而产生较高的背景,故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜(NC膜)

关于磷酸化蛋白检测的注意事项:

   1、保持待测蛋白处于磷酸化状态!在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂(NaF,可以防止去磷酸化),并将标本时刻保持在冰浴中!

   2、使用5%的BSA作为封闭试剂!不能使用脱脂奶粉!(因为脱脂奶粉中含有酪蛋白,会出现很高的背景)。

抗体保存注意事项:

  1、收到抗体后按要求离心后再打开管盖进行分装盒保存!

  2、对于大部分抗体,比较合适的保存方式是分装后保存在-20℃

(1)分装的量以一次实验用完为好,最少不能少于10μl每份。因为分装体积越小,抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响。

(2)复融后的分装抗体如果一次用不完,将剩余母液保存在4℃,避免再冻起来!

(3) 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。

  3、大部分抗体收到后4℃短暂保存1-2周对抗体活性是没有影响的。

  4、长期保存,加入叠氮钠,防止细菌污染。

 

 





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