土壤碳循环：S-CA活性检测

土壤碳酸酐酶（Soil Carbonic Anhydrase, S-CA）是一类催化CO₂水合反应（CO₂ + H₂O ↔ HCO₃⁻ + H⁺）的金属酶，广泛存在于土壤微生物、植物根系及土壤胶体中。S-CA通过调控土壤碳转化速率，参与全球碳循环与气候变化过程，其活性是表征土壤碳汇功能、微生物活性及土壤质量的重要生物学指标。准确测定S-CA活性，对于揭示土壤碳循环机制、评估土壤健康状况及制定碳管理策略具有重要意义。

催化反应机制

S-CA催化CO₂水合反应的米氏常数（Kₘ）通常为0.5-5 mM，催化效率（kcat/Kₘ）达10⁷-10⁸ M⁻¹s⁻¹，其活性检测基于以下反应特性：

• pH变化：反应产生H⁺导致体系pH降低

• 底物消耗：CO₂气体消耗导致压力变化

• 产物生成：HCO₃⁻可通过显色反应定量

主要检测方法比较

经典检测方法——pH-stat法

方法原理

在恒温水浴条件下，将土壤样品与CO₂饱和水溶液反应，通过自动滴定仪添加NaOH溶液维持反应体系pH恒定（通常pH 8.3），记录单位时间内消耗的NaOH量，计算S-CA催化生成的H⁺量，进而表征酶活性。

试剂与仪器准备

主要试剂

• CO₂饱和水溶液：通入纯CO₂气体30分钟（25℃时浓度约0.033 M）

• 0.05 M NaOH标准溶液：经邻苯二甲酸氢钾标定

• 磷酸缓冲液（0.1 M，pH 8.3）：含0.1 M NaCl（维持离子强度）

• 酶抑制剂：1 mM乙二胺四乙酸（EDTA，用于空白对照）

核心仪器

• pH-stat自动滴定系统（配备pH电极和自动加液装置）

• 恒温水浴摇床（控温精度±0.1℃）

• 高速冷冻离心机（10000×g）

• 研钵与过筛设备（2 mm尼龙筛）

操作步骤

样品采集与预处理

1. 田间采样：

◦ 多点混合采样（5-10点/样地），深度0-20 cm

◦ 去除植物残体、石块等杂质

◦ 新鲜土样过2 mm筛，4℃保存（24小时内测定）或-80℃冷冻保存

2. 样品制备：

◦ 称取5.00 g鲜土，加入20 mL磷酸缓冲液

◦ 冰浴研磨5分钟（保持低温以防止酶失活）

◦ 4℃下10000×g离心10分钟，取上清液作为粗酶提取液

活性测定

1. 反应体系配置：

◦ 25 mL CO₂饱和水溶液（30℃预热）

◦ 5 mL粗酶提取液

◦ 磁力搅拌速率500 rpm

2. pH-stat滴定：

◦ 初始pH调节至8.30±0.02

◦ 记录3分钟内维持pH所需0.05 M NaOH消耗量（ΔV）

◦ 空白对照：酶提取液经100℃水浴10分钟灭活后测定

结果计算

定义：1个S-CA活性单位（U）指在30℃、pH 8.3条件下，每分钟催化1 μmol CO₂水合反应所需的酶量

公式：S-CA活性（U·g⁻¹ soil） = (C×ΔV×Vₜ)/(t×Vₑ×W)

其中：

- C：NaOH标准溶液浓度（μmol·mL⁻¹）

- ΔV：3分钟内NaOH消耗体积（mL）

- Vₜ：酶提取液总体积（mL）

- Vₑ：测定用酶提取液体积（mL）

- t：反应时间（min）

- W：土壤样品干重（g，需测定土壤含水量换算）