代谢组学：三羧酸循环中间代谢物精准检测

三羧酸循环系列检测主要基于代谢组学分析技术，结合高效液相色谱 - 质谱联用（HPLC-MS/MS）、气相色谱 - 质谱联用（GC-MS）等方法，对三羧酸循环中的关键中间代谢物（如柠檬酸、异柠檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等）进行定性和定量分析。

其核心原理是利用不同代谢物在色谱柱中的保留行为差异实现分离，再通过质谱检测器对分离后的代谢物进行特异性识别和定量。通过比较样品中这些中间代谢物的含量变化，可反映三羧酸循环的代谢活性及相关生理病理状态。

仪器与试剂

（一）仪器

高效液相色谱 - 串联质谱仪（HPLC-MS/MS）：配备合适的色谱柱（如 C18 柱，2.1mm×150mm，3.5μm）、自动进样器、柱温箱等。

气相色谱 - 质谱联用仪（GC-MS）：配备毛细管色谱柱（如 DB-5MS，30m×0.25mm×0.25μm）、电子轰击离子源（EI）等。

高速冷冻离心机（转速≥15000r/min，温度可调控至 4℃）。

超声波提取仪。

氮吹仪。

超纯水制备系统（如 Milli-Q 系统）。

天平（精度为 0.0001g）。

移液器（10μL、100μL、1mL、5mL 等）。

离心管（1.5mL、10mL、50mL）。

容量瓶（1mL、10mL、50mL、100mL 等）。

微孔滤膜（0.22μm，有机相和水相）。

（二）试剂

三羧酸循环中间代谢物标准品：柠檬酸、异柠檬酸、α- 酮戊二酸、琥珀酸、富马酸、苹果酸等，纯度均≥98%。

甲醇：色谱纯。

乙腈：色谱纯。

甲酸：色谱纯。

乙酸铵：分析纯，用于配制流动相缓冲液。

正己烷：色谱纯。

叔丁基甲醚：色谱纯。

内标物：如氘代柠檬酸（citric acid-d4）、氘代琥珀酸（succinic acid-d6）等，纯度≥98%。

超纯水：由超纯水制备系统制备。

标准溶液的配制

单标储备液的配制：分别准确称取一定量的各三羧酸循环中间代谢物标准品，用甲醇 - 水（体积比 50:50）混合溶液溶解并定容，配制成浓度为 1.0mg/mL 的单标储备液，置于 - 80℃冰箱中避光保存，有效期为 3 个月。

混合中间液的配制：分别准确移取一定体积的各单标储备液，用甲醇 - 水（体积比 50:50）混合溶液稀释定容，配制成浓度为 100μg/mL 的混合中间液，置于 - 20℃冰箱中避光保存，有效期为 1 个月。

系列工作标准溶液的配制：准确移取不同体积的混合中间液，加入适量内标物（使内标物浓度保持恒定），用甲醇 - 水（体积比 50:50）混合溶液稀释，配制成浓度为 0.1ng/mL、1ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL 的系列工作标准溶液，现配现用。

样品处理

（一）样品采集与保存

动物组织样品：采集所需动物组织（如肝脏、心肌等），迅速用预冷的生理盐水冲洗去除血液，滤纸吸干水分，切成小块，放入液氮中快速冷冻，然后转移至 - 80℃冰箱中保存。

细胞样品：收集对数生长期的细胞，用预冷的 PBS 缓冲液洗涤 2-3 次，离心（1000r/min，4℃，5min）弃上清，加入适量液氮冷冻，-80℃冰箱保存。

植物样品：采集植物组织（如叶片、果实等），洗净后用滤纸吸干水分，液氮冷冻后，-80℃冰箱保存。

（二）样品提取

称取约 50mg 冷冻样品置于 1.5mL 离心管中，加入 500μL 预冷的甲醇 - 水（体积比 80:20）提取液（含内标物），用组织研磨仪在低温下研磨至匀浆。

超声提取 30min（功率 300W，温度 4℃），然后在 15000r/min、4℃条件下离心 15min，取上清液置于另一离心管中。

向残渣中加入 300μL 上述提取液，重复超声提取和离心步骤，合并两次上清液。

（三）净化与浓缩

向合并的上清液中加入 200μL 正己烷，涡旋混合 1min，12000r/min、4℃离心 10min，弃去上层有机相，保留下层溶液。

将下层溶液转移至氮吹管中，用氮吹仪在 30℃下吹至近干，加入 200μL 甲醇 - 水（体积比 50:50）混合溶液复溶，涡旋混合 1min。

15000r/min、4℃离心 10min，取上清液通过 0.22μm 微孔滤膜（水相）过滤，滤液置于进样瓶中，待测。

检测条件

（一）HPLC-MS/MS 检测条件

色谱条件

色谱柱：C18 柱（2.1mm×150mm，3.5μm）。

柱温：30℃。

流动相：A 相为 0.1% 甲酸水溶液，B 相为乙腈。

梯度洗脱程序：0-3min，5% B；3-10min，5%-30% B；10-15min，30%-95% B；15-18min，95% B；18-18.1min，95%-5% B；18.1-22min，5% B。

流速：0.3mL/min。

进样量：5μL。

质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI），正负离子模式切换。

离子源温度：350℃。

喷雾电压：正离子模式 4000V，负离子模式 3500V。

鞘气压力：35psi。

辅助气压力：10psi。

碰撞气压力：1.5mTorr。

检测模式：多反应监测（MRM），各代谢物的母离子、子离子、碰撞能量等参数根据标准品优化确定。

（二）GC-MS 检测条件（针对部分挥发性代谢物）

色谱条件

色谱柱：DB-5MS 毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）。

进样口温度：250℃。

载气：氦气（纯度≥99.999%），流速 1.0mL/min。

进样方式：分流进样，分流比 5:1。

进样量：1μL。

柱温程序：初始温度 60℃，保持 2min；以 8℃/min 升温至 200℃，保持 3min；再以 15℃/min 升温至 280℃，保持 5min。

质谱条件

离子源：电子轰击离子源（EI），电子能量 70eV。

离子源温度：230℃。

接口温度：280℃。

质量扫描范围：m/z 50-500。

溶剂延迟：3min。

检测模式：选择离子监测（SIM），根据各代谢物标准品质谱图确定特征离子。

测定步骤

仪器预热：打开 HPLC-MS/MS 或 GC-MS 仪器，进行预热，确保仪器各项性能参数稳定。

标准曲线绘制：将系列工作标准溶液按浓度由低到高的顺序注入仪器，每个浓度重复进样 3 次，记录各代谢物和内标物的峰面积。以各代谢物浓度与内标物浓度的比值为横坐标，各代谢物峰面积与内标物峰面积的比值为纵坐标，绘制标准曲线。

样品测定：将处理好的样品溶液注入仪器，按照上述检测条件进行测定，记录样品中各代谢物和内标物的峰面积。每个样品重复进样 3 次，取平均值。